磷酸化樣本檢測不到？可能你的樣本需要來點刺激的！
磷酸化樣本檢測不到？可能你的樣本需要來點刺激的！
近幾年，Proteintech 一直致力於拓寬新的產品線，其中之一就是磷酸化抗體。截至目前的磷酸化抗體數量已經有幾百種，包含兔多抗 (Rabbit polyclonal antibody)、鼠單抗 (Mouse monoclonal antibody)、兔重組單抗 (Rabbit recombinant antibody)。
在磷酸化抗體研發的過程中，我們發現選擇合適的刺激條件，是磷酸化蛋白檢測中至關重要的一步。
今天就來為大家說明，在磷酸化蛋白檢測中，有哪些常用的刺激方法吧~
主要包括：缺氧誘導 (Hypoxia stress), DNA損傷誘導 (DNA damage), AMPK 活化 (AMP-activated protein kinase activation), PKC活化 (Protein kinase C activation)，磷酸酶抑制 (Phosphatase inhibitor), mTOR抑制 (Mammalian target of rapamycin inhibition) 以及PI3K抑制 (Phosphoinositide 3-kinase inhibition) 等。
1. Cobalt Chloride 刺激模擬缺氧環境
缺氧環境下，許多蛋白磷酸化的程度會有明顯變化，而氯化鈷（cobalt chloride，CoCl2）可用於模擬細胞缺氧環境。
一方面 Co2+ 通過直接取代類血紅素中的 Fe2+ 使血紅素不能與 O2 結合而維持缺氧狀態；另一方面，Co2+ 會置換 prolyl hydroxylase 以及 aspartic acid hydroxylase 催化基團上的 Fe2+，進而抑制缺氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）的降解，活化了 HIF-1 signaling pathway。
Tips：處理細胞過程使用缺氧培養箱，通過調控 N2、Co2、O2 的比例來達成低氧或缺氧環境。需要注意的是，CoCl2 處理無法完全達成缺氧條件 (Fig. 1，參考文獻 1)。
▲Fig. 1 在CoCl2處理和正常缺氧環境下，STAT3的磷酸化表現量顯示出不一致的趨勢。
2. Etoposide、MMS 誘導 DNA 損傷
Etoposide是TOP Ⅱ (Topoisomerase Ⅱ) 的抑制劑。Etoposide 能與 TOP Ⅱ 及 DNA 形成複合物，導致 DNA 無法修復而造成 DNA 損傷。
ATM（ataxia telangiectasia-mutated）Ser1981 位點會發生自磷酸化 (Autophosphorylation)，參與 DNA 損傷過程。CHEK2 (Checkpoint kinase 2) 作為 ATM 受質，使 Thr68 位點被磷酸化並活化，進而磷酸化下游 p53 的 Ser15 位點，這一系列過程使細胞停滯在 G2/M 時期。此外，Etoposide 也對癌細胞具有殺傷作用，成為抗腫瘤藥物。類似造成 DNA 損傷的還有 MMS (Methyl methanesulfonate)，一種烷基化劑 (Alkylating agents)，也是一種潛在的致癌物 (Fig. 2)。
▲Fig. 2 Etoposide 誘導 HT-29 細胞 P53(Ser15) 磷酸化和 MMS 誘導 PC-3 細胞 CHEK2(Thr68) 磷酸化。
3. AICAR 啟動 AMPK 訊息傳遞
AICAR (AICA ribonucleotide) 是 AMP 的類似物。AICAR 由腺苷轉運蛋白 (Adenosine transport protein) 轉入細胞後，被 adenosine kinase 磷酸化後形成 ZMP (AICAR monophosphate)。ZMP 可類比 AMP 對 AMPK 及 AMPKK 的活化，而高濃度的 AICAR 會促進細胞凋亡 (參考文獻 2)。
4. Forskolin 啟動 cAMP 信號
Forskolin（Coleonol）是從毛喉鞘蕊花 (Coleus barbatus) 分離的二萜類化合物 (Diterpene) 屬於脂溶性化合物，能穿透細胞膜刺激 adenylate cyclase 將ATP 轉變成 cAMP，進一步導致多種蛋白的磷酸化水平發生改變。例如 Forskolin 處理細胞增加了 CREB（cAMP-response element binding protein）的磷酸化 (Fig. 4)。
▲Fig. 4 Forskolin 誘導 HSC-T6 細胞 CREB1(Ser133) 磷酸化。
5. PMA 啟動 PKC pathway
PMA 別名 TPA，廣泛用於 in vivo/in vitro 實驗，PMA 可以結合且活化 PKC，也能促進 CREB 磷酸化。
另外 PMA 還會誘導 THP-1 細胞分化為巨噬細胞。
6. BMP-2/Smads signaling 啟動
BMP-2 (Bone morphogenetic protein 2) 是成骨作用 (Osteogenesis) 和誘導成骨細胞分化 (osteoblast differentiation) 的胞外訊號關鍵分子之一。BMP-2 有兩種受體（BMPRs），均具有 serine/threonine kinases 活性，可直接作用並磷酸化下游的 Smads 蛋白，磷酸化的 Smads 從細胞質轉移到細胞核，調控基因轉錄 (Fig. 5，參考文獻 3)。
▲Fig. 5 BMP2 誘導皮質神經元和 HepG2 細胞 SMAD1 磷酸化。
7. Staurosporine 抑制蛋白激酶（Protein kinase）活性
星形孢菌素（Staurosporine）是從細菌 (Streptomyces staurosporeus) 分離出的天然生物鹼 (alkaloid)，屬於 ATP 競爭型蛋白激酶抑制劑，可抑制 PKC、PKA 等活性。
用 Staurosporine 處理 SH-SY5Y 細胞，能通過 Caspase-dependent and -independent pathway 引起細胞死亡；在細胞週期檢測中，0.5nM Staurosporines 能有效使細胞阻滯在 G2/M 週期。
8. Nocodazole 抑制微管聚合
Nocodazole 是一種能使微管聚合 (Microtubules polymerization) 的可逆抑制劑，實驗室常使用 Nocodazole 調控細胞停滯在 G2/M 週期或誘導細胞凋亡。細胞在同步到有絲分裂時 ASK1 被啟動。ASK1 又分別通過 MKK3/MKK6和MKK4/MKK7 的磷酸化啟動 p38 和 JNK (Fig. 6，參考文獻 4)。