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磷酸化樣本檢測不到?可能你的樣本需要來點刺激的!

磷酸化樣本檢測不到?可能你的樣本需要來點刺激的!

磷酸化樣本檢測不到?可能你的樣本需要來點刺激的!

 

近幾年,Proteintech一直致力於拓寬新的產品線,其中之一就是磷酸化抗體。截至目前的磷酸化抗體數量已經有幾百種,包含兔多抗 (Rabbit polyclonal antibody)、鼠單抗 (Mouse monoclonal antibody)、兔重組單抗 (Rabbit recombinant antibody)。

在磷酸化抗體研發的過程中,我們發現選擇合適的刺激條件,是磷酸化蛋白檢測中至關重要的一步。

 

今天就來為大家說明,在磷酸化蛋白檢測中,有哪些常用的刺激方法吧~

主要包括:缺氧誘導 (Hypoxia stress)DNA損傷誘導 (DNA damage)AMPK 活化 (AMP-activated protein kinase activation)PKC活化 (Protein kinase C activation)磷酸酶抑制 (Phosphatase inhibitor)mTOR抑制 (Mammalian target of rapamycin inhibition) 以及PI3K抑制 (Phosphoinositide 3-kinase inhibition) 等。

 

1. Cobalt Chloride刺激模擬缺氧環境

缺氧環境下,許多蛋白磷酸化的程度會有明顯變化,而氯化鈷(cobalt chloride,CoCl2)可用於模擬細胞缺氧環境。

一方面Co2+通過直接取代類血紅素中的Fe2+使血紅素不能與O2結合而維持缺氧狀態;另一方面,Co2+會置換prolyl hydroxylase以及aspartic acid hydroxylase 催化基團上的Fe2+,進而抑制缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)的降解,活化了 HIF-1 signaling pathway。

Tips:處理細胞過程使用缺氧培養箱,通過調控N2、Co2、O2的比例來達成低氧或缺氧環境。需要注意的是,Co​Cl2處理無法完全達成缺氧條件 (Fig. 1,參考文獻 1)。

 

▲Fig. 1 在CoCl2處理和正常缺氧環境下,STAT3的磷酸化表現量顯示出不一致的趨勢。

 

2. Etoposide、MMS誘導DNA損傷

Etoposide是TOP Ⅱ (Topoisomerase Ⅱ) 的抑制劑。Etoposide能與TOP Ⅱ及DNA形成複合物,導致DNA無法修復而造成DNA 損傷。

ATM(ataxia telangiectasia-mutated)Ser1981位點會發生自磷酸化 (Autophosphorylation),參與DNA損傷過程。CHEK2 (Checkpoint kinase 2) 作為ATM受質,使Thr68位點被磷酸化並活化,進而磷酸化下游p53的Ser15位點,這一系列過程使細胞停滯在G2/M時期。此外,Etoposide也對癌細胞具有殺傷作用,成為抗腫瘤藥物。類似造成DNA損傷的還有MMS (Methyl methanesulfonate),一種烷基化劑 (Alkylating agents),也是一種潛在的致癌物 (Fig. 2)。

 

▲Fig. 2  Etoposide誘導HT-29細胞P53(Ser15) 磷酸化和MMS誘導PC-3細胞CHEK2(Thr68) 磷酸化。

 

3. AICAR啟動AMPK訊息傳遞

AICAR (AICA ribonucleotide) 是AMP的類似物。AICAR由腺苷轉運蛋白 (Adenosine transport protein) 轉入細胞後,被adenosine kinase 磷酸化後形成ZMP (AICAR monophosphate)。ZMP可類比AMP對AMPK及AMPKK的活化,而高濃度的AICAR會促進細胞凋亡 (參考文獻 2)。

 

4. Forskolin啟動cAMP信號

Forskolin(Coleonol)是從毛喉鞘蕊花 (Coleus barbatus) 分離的二萜類化合物 (Diterpene) 屬於脂溶性化合物,能穿透細胞膜刺激adenylate cyclase 將ATP轉變成cAMP,進一步導致多種蛋白的磷酸化水平發生改變。例如Forskolin處理細胞增加了CREB(cAMP-response element binding protein)的磷酸化 (Fig. 4)。

 

▲Fig. 4  Forskolin誘導HSC-T6細胞CREB1(Ser133) 磷酸化。

 

5. PMA啟動PKC途徑

PMA別名TPA,廣泛用於in vivo/in vitro實驗,PMA可以結合且活化PKC,也能促進CREB磷酸化。

另外PMA還會誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞。

 

6. BMP-2/Smads通路啟動

BMP-2 (Bone morphogenetic protein 2) 是成骨作用 (Osteogenesis) 和誘導成骨細胞分化 (osteoblast differentiation) 的胞外訊號關鍵分子之一。BMP-2有兩種受體(BMPRs),均具有serine/threonine kinases 活性,可直接作用並磷酸化下游的Smads蛋白,磷酸化的Smads從細胞質轉移到細胞核,調控基因轉錄 (Fig. 5,參考文獻 3)。

 

▲Fig. 5 BMP2誘導皮質神經元和HepG2細胞SMAD1 磷酸化。

 

7. Staurosporine抑制蛋白激酶(Protein kinase)活性

星形孢菌素(Staurosporine)是從細菌 (Streptomyces staurosporeus) 分離出的天然生物鹼 (alkaloid),屬於ATP競爭型蛋白激酶抑制劑,可抑制PKC、PKA等活性。

用Staurosporine處理SH-SY5Y細胞,能通過Caspase-dependent and -independent pathway引起細胞死亡;在細胞週期檢測中,0.5nM Staurosporines能有效使細胞阻滯在G2/M週期。

 

8. Nocodazole抑制微管聚合

Nocodazole是一種能使微管聚合 (Microtubules polymerization) 的可逆抑制劑,實驗室常使用Nocodazole調控細胞停滯在G2/M週期或誘導細胞凋亡。細胞在同步到有絲分裂時ASK1被啟動。ASK1又分別通過MKK3/MKK6和MKK4/MKK7的磷酸化啟動p38和JNK (Fig. 6,參考文獻 4)。