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【Proteintech】Western Blot (WB) 實驗結果真相大解析- 觀測分子量 vs. 預測分子量

【Proteintech】Western Bolt (WB) 實驗結果真相大解析-

觀測分子量 vs. 預測分子量

Western Blot Troubleshooting Part 1：

Western blotting 是檢測蛋白質表現量的實驗方法，利用抗體與蛋白質抗原專一性結合的原理，通過訊號表現和成像的位置分析，獲得目標蛋白質在細胞或組織中表現情況的相關資訊。

倍思特小編將在這篇文章帶大家了解：

➣ Western blot 觀測分子量和預測分子量異常可能原因

➣ 影響蛋白質分子量因素：

     1. 信號肽和前胜鏈被水解切割 (Signal peptide and a pro-peptide gets cleaved off) 

      2. 蛋白質轉譯後修飾 (Post-translational modification)
          a.) 聚醣化和醣基化 (Glycosylation and glycanation)
          b.) 磷酸化 (Phosphorylation)
          c.) 泛素化 (Ubiquitination)

     3. 蛋白質複合物 (Protein complexes)

     4. 蛋白質異構體 (Protein isoforms)

     5. 技術問題 (Technical obstacles)
         a.) 抗體交叉反應 (Antibody cross-reactivity)
         b.) 非特異性蛋白水解切割和蛋白質降解 (Unspecific proteolytic cleavage and protein degradation)

➣ Summary table

為什麼觀察到的蛋白質分子量 (molecular weight, MW) 與計算的不同?

蛋白質的分子量預測是所有蛋白質氨基酸的分子量之總和，可以使用工具 (e.g., ExPASy) 進行計算。

由於 SDS-PAGE 是在變性條件 (denaturing conditions) 進行的實驗，因此蛋白質會依據分子量遷移，並且與二級/三級結構、電荷或蛋白質-蛋白質相互作用無關，表示分子量較小的蛋白質比分子量較大的蛋白質遷移得更快。

通常計算出的分子量與在 Western blot 實驗結果觀察到不同。在這裡，我們整理了最常見原因 (Fig. 1)。

Fig. 1 影響蛋白質分子量的相關因素。

Western blot 觀測分子量和預測分子量異常可能原因

1. 信號肽 (signal peptide) 和前胜鏈 (pro-peptide) 被水解切割

Signal peptide 可以通過各種數據庫或先前公佈的數據來進行預測 (e.g., UniProt) 。有些蛋白質前體 (protein precursor) 的蛋白質結構域有 pro-peptides，需要通過蛋白酶 (protease) 水解切割 pro-peptide 後才能產生功能性產物 (Fig. 2) 。另外，許多通過分泌途徑 (secretory pathway) 轉運的蛋白質 N-terminus 具有 15-35 個氨基酸的 signal peptide，在亞細胞運輸過程 (subcellular transport) 中經常被各種蛋白酶水解，這導致觀察到成熟蛋白質經由電泳表現的位子低於預測的分子量。

Fig.2 PINK1 (Cat No. 23274-1-AP) 屬於 mitochondrial serine/threonine-protein kinase，可保護細胞免受應力誘發的線粒體功能障礙。PINK1 的 precursor (65 kDa) 在細胞基質 (cytosol) 合成，被導入線粒體的外膜後再進一步轉移到內膜中並被切割為成熟形式 (mature form, 45 kDa) 。

Caspases 是調節細胞發炎和細胞死亡的關鍵參與者。Caspase 3 (Cat No. 66470-2-Ig) 以 p32 (32 kDa) 無活性原酶形式存在，在凋亡信號傳導後，Caspase 3 會被分解成兩個活性亞基 p19/17 和 p12 。

Matrix metalloproteinase (MMP) 系列的蛋白質參與許多細胞外基質 (ECM) 的生理過程，大多數 MMP蛋白處於非活化狀態 (inactive proproteins)，而被細胞外蛋白酶 (extracellular proteinases) 分解時活化。pro-MMP9 (Cat No. 10375-2-AP, 92 kDa) 為非活化狀態。pro-MMP9會被 MMP3 活化，以 intermediate form (78/82 kDa, PMID: 1371271) 形式依次切割成 processed form (68 kDa) 。此外，MMP9 也會以二聚體 (dimer, 180 kDa) 的形式存在。

2. 蛋白質轉譯後修飾 (Post-translational modification)

     a. ) 聚醣化 (Glycanation) 和醣基化 (Glycosylation)

真核生物中最常見的兩種醣基化類型是 N-linked glycosylation (asparagine) 和 O-linked glycosylation (serine, threonine)，由於增加了額外的分子量且不包括在原始蛋白質序列中，這使得蛋白質遷移更慢 (Fig. 3,4) 。

Fig. 3 PD-L1 (Programmed cell death ligand 1, Cat No. 66248-1-Ig) 是一種第I型跨膜蛋白，在免疫反應中扮演關鍵的調節作用。PD-L1 全長為 33 kDa，其中 N-linked glycosylation 後分子量為 45-70 kDa，主要醣基化形式為 45-50 kDa 。

CD133 (Prominin 1, PROM1, Cat No. 66666-1-Ig) 為跨膜醣蛋白 (transmembrane glycoprotein)，在高度醣基化狀態的分子量為 115-120 kDa，使用糖苷水解酶 (glycosidase) 處理後可觀察到的分子量為 80-90 kDa。

蛋白聚醣 (Proteoglycans) 屬於細胞外基質醣蛋白，基本構成為無支鏈的糖胺聚醣鏈 (glycosaminoglycan chains) 共價連接到核心蛋白 (core protein) 。通常，醣基的分子量大於蛋白質成分。

Fig. 4 Decorin (Cat No. 14667-1 -AP) 在非聚醣化狀態的分子量為 43-47 kDa，聚醣化狀態的分子量為 80-120 kDa。

     b.) 磷酸化 (Phosphorylation)

磷酸化是最常見的轉譯後修飾之一，發生在 serine、threonine 或 tyrosine 殘基的位點上，磷酸化由磷酸酶 (phosphatases) 催化並且是可逆的形式，而多個磷酸化位點會導致更明顯的分子量變化 (Fig. 5) 。

Fig. 5 serine/threonine-protein kinase AKT 在許多細胞過程中發揮作用。存活因子 (survival factors) 可以透過活化 serine/threonine-protein kinase AKT1 以不依賴於轉錄的機制抑制細胞凋亡 (Cat No. 60203-2-Ig 檢測 total AKT； Cat No. 66444-1-Ig 檢測 AKT-phospho-S473) 。

    c.) 泛素化 (Ubiquitination)

泛素 (ubiquitin) 是一種小型蛋白質 (8.6 kDa)，幾乎可以在所有類型組織中表達。蛋白質泛素化是指將泛素與蛋白受質共價鍵結 (e.g., lysine、cysteine、serine、hreonine 或 N-terminus)，通過蛋白質體 (proteome) 的泛素化可以標記蛋白質以進行降解，可以是單泛素化 (單個泛素分子) 或多泛素化的狀態，對於細胞信號傳導、膜蛋白的內化 (internalization) 以及轉錄的調節扮演重要的角色 (Fig. 6) 。

Fig. 6 Ubiquitin B (UBB, Cat No.10201-2-AP) 該基因是由三個無間格的泛素編碼序列重複組成，是非溶酶體胞內的異常蛋白質降解與正常蛋白質的快速周轉所必需的泛素，作用過程需要依賴 ATP 。

3. 蛋白質複合物 (Protein complexes)

Western blot SDS-PAGE 是在還原狀態條件下進行的實驗，表示大多數由通過非共價鍵連接所組成的蛋白質複合物會在樣品製備和電泳過程中解離，並且作為單體 (monomer) 運行。然而，即使在 SDS 和 β-Mercaptoethanol 存在的情況下，一些蛋白質仍存在於同聚 (homomeric) 或異聚 (heteromeric) 複合物的狀態 (Fig. 7)。另外，一些蛋白質是從天然蛋白質複合物或脂質膜中釋放出來 (e.g., 跨膜蛋白質和具有疏水結構域的蛋白質)，會在細胞裂解過程中聚集 (aggregate)，具有高分子量，但可能不代表是在天然狀態發生的相互作用。在這種情況下，觀察到的分子量可能大大高於預測單體形式的分子量。

Tips： 4X SDS sample buffer 添加 20% β-Mercaptoethanolc 或 100 mM DTT 可能有助於去除蛋白質複合物解離的非特異性條帶。

Fig. 7 NQO1 (Cat No. 11451-1-AP) 屬於 NAD(P)H dehydrogenase 的成員，可作為醌還原酶 (quinone reductase) ，也會參與解毒途徑 (detoxification pathways) 以及生物合成過程 (biosynthetic processes) 中與對苯二酚 (hydroquinones) 的共軛反應 (e.g., 參與凝血脢原合成 (prothrombin synthesis) 中維生素 K 依賴性羧化 (vitamin K-dependent carboxylation) 反應，NQO1 具有三種異構體，分子量分別為 26、27 和 31 kDa，需要形成 homodimer (66-70 kDa) 才具有酵素活性。

Mlx-interacting protein (MLXIP, MONDOA, Cat No. 13614-1-AP) 通過與 MLX 蛋白形成 heterodimer 的形式來做為轉錄因子，調控糖解作用和葡萄糖反應相關基因的活化。MLXIP 具有三種異構體，分子量分別為 110、57 和 69 kDa，而 MLXIP-MLX heterodimer 分子量為 130 kDa 。

4. 蛋白質異構體 (Protein isoforms)

蛋白異構體是指同一基因轉錄 mRNA 後，在成熟過程中經由選擇性剪接 (alternative splicing) 將外顯子 (exon) 及內含子 (intron) 包含或排除在最終的 mRNA 產物中，最後產生不同的蛋白產物 (Fig. 8)。另外，包含額外蛋白質編碼序列 (protein-coding sequences) 會表現在更高分子量。另一方面，序列可以引入替代 (過早) 的終止密碼子，導致蛋白質的分子量較低。有些蛋白質具有多個轉譯起始位點，這會產生不同 N-terminus 的異構體。蛋白質異構體具有不同的半衰期和亞細胞定位 (subcellular localization)，可以與不同的蛋白質相互作用，形成特殊蛋白質複合物，並具有不同甚至相反的功能。

Fig. 8 GLS (GLS1, KIAA0838) 屬於 glutaminase 的成員。GLS 有三種異構體，分別為 KGA / GAM / GAC，分子量與組織表達模式各不相同 (PMID: 11015561) 。KGA (kidney-type glutaminase, 65 kDa) 。GAC (glutaminase C, 58 kDa)，基因剪接 (gene splicing) 導致 KGA 的 C-terminal domain 丟失而形成的異構體。GAM 是最短的異構體並且沒有催化活性，包含內含子 2 和過早終止密碼子組成。(Cat No. 12855-1-AP 檢測 KGA / GAC； Cat No. 20170-1-AP 特異性檢測 KGA； Cat No. 23549-1-AP 檢測 GLS 的所有三種異構體 (KGA / GAM / GAC)； Cat No. 19958-1-AP 特異性檢測GAC) 。

PARD3 (ASIP, Par3, Bazooka) 是不對稱細胞分裂 (asymmetric cell division) 和極化生長 (polarized growth) 至關重要的 PARD 蛋白。PARD3 (Cat No. 11085-1-AP) 可識別 PARD3 的所有三種主要異構體，分子量分別為 100 kDa、150 kDa 和 180 kDa 。

5. 技術問題

    a. ) 抗體交叉反應

抗體不僅可以辨識目標蛋白，也有可能與分析樣品中的其他蛋白質發生非特異性交叉反應。

設置適當的對照組可以避免此問題 :

       陽性對照 (Positive controls)

       - 純化的目標蛋白

       - 已知表達目標蛋白的細胞裂解物

       - 過表達目標蛋白的細胞裂解物

       陰性對照 (Negative controls)

       - 具有較低目標蛋白表達的細胞裂解物

       - 目標蛋白 knocked down (e.g., siRNA 或 shRNA) 或 knocked out (e.g., CRISPR) 的細胞裂解物。

    b. ) 非特異性蛋白水解切割 (proteolytic cleavage) 和蛋白質降解 (degradation)

當蛋白質樣品處理不當時，細胞裂解或組織提取過程中釋放的蛋白酶會導致蛋白質碎裂 (fragmentation)，產生較低分子量的片段，又或一些蛋白質相較其他蛋白質更容易降解。根據裂解條件選擇適當的試劑，以及添加蛋白酶抑製劑，可以更有效提取目標蛋白。

Summary table

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