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Western Blot (WB) 實驗結果真相大解析- 觀測分子量 vs. 預測分子量

Western Blot (WB) 實驗結果真相大解析- 觀測分子量 vs. 預測分子量

Western Bolt (WB) 實驗結果真相大解析-

 

觀測分子量 vs. 預測分子量

 

 

Western Blot Troubleshooting Part 1:

Western blotting 是檢測蛋白質表現量的實驗方法,利用抗體與蛋白質抗原專一性結合的原理,通過訊號表現和成像的位置分析,獲得目標蛋白質在細胞或組織中表現情況的相關資訊。

 

倍思特小編將在這篇文章帶大家了解:

➣ Western blot 觀測分子量和預測分子量異常可能原因

➣ 影響蛋白質分子量因素:

     1. 信號肽和前胜鏈被水解切割 (Signal peptide and a pro-peptide gets cleaved off) 

      2. 蛋白質轉譯後修飾 (Post-translational modification)
          a.) 聚醣化和醣基化 (Glycosylation and glycanation)
          b.) 磷酸化 (Phosphorylation)
          c.) 泛素化 (Ubiquitination)

     3. 蛋白質複合物 (Protein complexes)

     4. 蛋白質異構體 (Protein isoforms)

     5. 技術問題 (Technical obstacles)
         a.) 抗體交叉反應 (Antibody cross-reactivity)
         b.) 非特異性蛋白水解切割和蛋白質降解 (Unspecific proteolytic cleavage and protein degradation)

➣ Summary table

為什麼觀察到的蛋白質分子量 (molecular weight, MW) 與計算的不同?

蛋白質的分子量預測是所有蛋白質氨基酸的分子量之總和,可以使用工具 (e.g., ExPASy) 進行計算。

由於 SDS-PAGE 是在變性條件 (denaturing conditions) 進行的實驗,因此蛋白質會依據分子量遷移,並且與二級/三級結構、電荷或蛋白質-蛋白質相互作用無關,表示分子量較小的蛋白質比分子量較大的蛋白質遷移得更快。

通常計算出的分子量與在 Western blot 實驗結果觀察到不同。在這裡,我們整理了最常見原因 (Fig. 1)。

Fig. 1 影響蛋白質分子量的相關因素。

 

Western blot 觀測分子量和預測分子量異常可能原因

1. 信號肽 (signal peptide) 和前胜鏈 (pro-peptide) 被水解切割

Signal peptide 可以通過各種數據庫或先前公佈的數據來進行預測 (e.g., UniProt) 。有些蛋白質前體 (protein precursor) 的蛋白質結構域有 pro-peptides,需要通過蛋白酶 (protease) 水解切割 pro-peptide 後才能產生功能性產物 (Fig. 2) 。另外,許多通過分泌途徑 (secretory pathway) 轉運的蛋白質 N-terminus 具有 15-35 個氨基酸的 signal peptide,在亞細胞運輸過程 (subcellular transport) 中經常被各種蛋白酶水解,這導致觀察到成熟蛋白質經由電泳表現的位子低於預測的分子量。

Fig.2 PINK1 (Cat No. 23274-1-AP) 屬於 mitochondrial serine/threonine-protein kinase,可保護細胞免受應力誘發的線粒體功能障礙。PINK1 的 precursor (65 kDa) 在細胞基質 (cytosol) 合成,被導入線粒體的外膜後再進一步轉移到內膜中並被切割為成熟形式 (mature form, 45 kDa) 。

Caspases 是調節細胞發炎和細胞死亡的關鍵參與者。Caspase 3 (Cat No. 66470-2-Ig) 以 p32 (32 kDa) 無活性原酶形式存在,在凋亡信號傳導後,Caspase 3 會被分解成兩個活性亞基 p19/17 和 p12 。

Matrix metalloproteinase (MMP) 系列的蛋白質參與許多細胞外基質 (ECM) 的生理過程,大多數 MMP蛋白處於非活化狀態 (inactive proproteins),而被細胞外蛋白酶 (extracellular proteinases) 分解時活化。pro-MMP9 (Cat No. 10375-2-AP, 92 kDa) 為非活化狀態。pro-MMP9會被 MMP3 活化,以 intermediate form (78/82 kDa, PMID: 1371271) 形式依次切割成 processed form (68 kDa) 。此外,MMP9 也會以二聚體 (dimer, 180 kDa) 的形式存在。

 

2. 蛋白質轉譯後修飾 (Post-translational modification)

     a. ) 聚醣化 (Glycanation) 和醣基化 (Glycosylation)

真核生物中最常見的兩種醣基化類型是 N-linked glycosylation (asparagine)O-linked glycosylation (serine, threonine),由於增加了額外的分子量且不包括在原始蛋白質序列中,這使得蛋白質遷移更慢 (Fig. 3,4) 。