【Proteintech】 免疫螢光結果不理想,可能是固定劑和通透劑的鍋?!
【Proteintech】 免疫螢光結果不理想,可能是固定劑和通透劑的鍋 ?!
在所有抗體相關實驗當中,如果說西方點墨法(WB, Western blot)是最樸素無華的,那免疫螢光(IF, Immunofluorescence)一定是最絢爛奪目的那個!
道理我們都懂,IF實驗也做完了~
可是,為什麼我的蛋白定位和別人做的不一致呢?
FEN1抗體(貨號:14768-1-AP)染NIH/3T3細胞
FEN1是一種結構特異性核酸酶,理論上應在細胞核 (nucleus) 表達,前人研究中免疫螢光結果與預期一致,細胞核染色(左圖)。而右圖為使用相同的抗體anti-FEN1(貨號:14768-1-AP)染乙醇固定的NIH/3T3細胞 ,結果細胞質染色,與預期及前人結果相悖。
不要慌! 作為抗體應用專家,免疫螢光小能手,小編這就給研究人員們整理一些,為什麼會出現螢光信號不符的情況?究竟是什麼原因呢?
1. 固定劑
做過細胞IF實驗的小夥伴都知道,在取得樣本之後,很重要的一步就是要對細胞進行固定。固定,顧名思義就是將細胞“固定”起來,這樣能長久的保持細胞形態和抗原狀態,讓抗原能夠與抗體更充分且更穩定地結合。
可有多少實驗者知道,固定劑也會影響蛋白(抗原 antigen)的亞細胞定位(指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位。例如蛋白於核內、胞質內或者細胞膜上存在)實驗結果?
例如,我們研究部分核蛋白(nucleoprotein)時發現如果採用乙醇(ethanol)固定,就會出現細胞質(cytosol)染色的結果。
B23/NPM1抗體(貨號:60096-1-Ig)染MCF-7細胞
左圖4%多聚甲醛(Paraformaldehyde, PFA)固定MCF-7細胞(細胞核染色-陽性),右圖乙醇固定(細胞質染色-非特異性染色)。
而當我們用E-cadherin抗體染細胞膜時,如果採用的是4%多聚甲醛固定,也會出現細胞核假陽性信號。
E-cadherin抗體(貨號:20874-1-AP)為細胞膜染色
左圖4% PFA固定MCF-7細胞(細胞核染色-非特異性染色),右圖乙醇固定(細胞膜染色-陽性)。
顯然,固定劑確實會影響到蛋白(抗原antigen)的亞細胞定位實驗結果。不同固定劑的作用原理不同,不同目標蛋白及所用抗體特性不同,都可能影響到固定劑使用效果。
因此選對合適的固定劑對於準確的 IF 數據是至關重要的。
那麼該如何挑選合適的固定劑呢?且往下看:
常用的固定劑種類很多,一般常用固定劑可分為兩大類:可溶性溶劑和交聯劑
可溶性溶劑: 如丙酮(Propanone/Acetone)、乙醇等能去除脂類物質並使細胞脫水,把蛋白質沉澱在細胞結構上。
交聯劑: 如 PFA 可以通過自由氨基基團把生物分子橋連起來,形成一個相互連接的抗原網。
組織或細胞經過固定後可使胞內蛋白凝固,減少或終止外源性酶(Exogenous enzymes)和內源性酶(Endogenous enzymes)的反應;保持組織或細胞的抗原性,避免抗原發生彌散;保持組織和細胞的固有形態和結構。
不同類型固定劑優缺點如下:
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可溶性溶劑 |
交聯劑 |
優點 |
1.固定時間快 2.對組織穿透性強,抗原免疫活性保存較好 3. 結構清晰,染色鮮豔 4.可溶解膜磷脂(Membrane phospholipid),無需額外通透 |
1.成本較低 2.組織收縮較少,損傷少,保存固有物質較好 3.固定均勻,穿透性強 4.能使組織硬化,增進組織彈性,有利於切片 5.能保存脂肪及脂類物質 |
缺點 |
1.具有揮發性和毒性大量接觸和吸入對人體有害 2.對組織脫水性強,使組織收縮較大 |
1.具有毒性及揮發性還可能導致標本乾涸 2.產生福爾馬林色,影響觀察效果 Tip: 3.含雜質較多如甲醇,鈍化酵素活性,影響反應 |
Proteintech根據多年抗體開發以及蛋白檢測經驗,總結了一份【不同細胞器首選固定劑方法】,提供實驗者參考
不同細胞器首選固定方法 |
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亞細胞器 |
首選固定劑 |
亞細胞器 |
首選固定劑 |
細胞膜 |
A或B |
纖毛 |
A |
細胞核 |
A |
黏著斑 |
B 或 A |
細胞核膜 |
B 或 A |
溶酶體 |
A 或 B |
細胞核仁 |
B |
線粒體 |
A |
核醣體 |
B |
過氧化物酶體 |
A或B |
高爾基體 |
A |
自噬體 |
B |
內質網 |
A |
細胞骨架(微管) |
A |
中心體 |
B |
細胞骨架(微絲) |
A 或 B |
紡錘體 |
A |
細胞骨架(中間纖維) |
B |
Tip: |
當然,固定劑的選擇其實是沒有通用的規則,以上表格也是經驗之談,不排除有特殊情況。如果沒有達到預期的實驗效果,小夥伴們也可以嘗試更換其他固定試劑。
2. 通透劑
說到了固定劑,那就必須聊一下通透劑,通透劑沒選好同樣會造成IF結果不理想。
交聯固定劑比有機溶劑能更完整的保持細胞結構,保存脂類物質,但也會因此而阻礙抗體-抗原的結合,甚至屏蔽抗原表位(Antigenic epitope),造成陰性檢測結果。
因此可能需要增加一個通透步驟以使抗體能夠順利進入並接觸抗原。我們可以根據目標所處的位置進行選擇使用或者不使用通透劑,以及選擇何種強度的通透劑。
1)檢測胞外表位 如:細胞膜表面蛋白(Membrane protein)、膜整合蛋白(Integral membrane protein)的胞外段等
無需進行通透,固定之後即可檢測。
2)檢測胞內表位 如:膜整合蛋白的胞內段、細胞骨架蛋白、細胞器膜外蛋白等
則需選擇較溫和的細胞通透劑:Digitonin、Leucoperm、Saponin或Tween 20等,這些細胞通透劑能夠在細胞膜上打孔,增加通透性,使抗體進入胞質中並識別胞質中的抗原表位。
3)檢測有膜细胞器内表位 如:核內蛋白、線粒體內的蛋白等
則需要採用強通透劑:Triton X-100和NP-40等,可以部分溶解細胞核膜等細胞器膜結構,使抗體進入細胞器內部識別抗原並結合抗原表位。
3. 其他可能性
總而言之呢,免疫螢光結果不理想,可能的原因非常多,其中固定劑和通透劑的選擇也至關重要的一步,希望大家要牢記!
除此之外的可能原因,倍思特小編總結了一份【免疫螢光疑難解析】,針對各種不理想情況解析了各種可能性,希望對大家有所幫助!
免疫螢光疑難解析 |
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效果 |
原因 |
解析 |
染色淺/無 |
封閉(Blocking)時間過長 |
封閉時間應保持常溫 1h 左右,或 4℃ 過夜 |
抗體濃度過低,作用時間較短 |
提高抗體濃度,作用時間不可少於 1h |
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抗體作用溫度不當 |
25-30℃ 作用時間 1-2h 如需過夜應置於 4℃ 冰箱內 |
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操作過程中緩衝液殘留過多,間接稀釋抗體濃度 |
每步驟用於沖洗的緩衝液盡量瀝乾 |
|
濾光片選擇不合適 |
更換濾光片 |
|
染色深 |
封閉時間過短 |
封閉時間應保持常溫 1h 左右,或 4℃ 過夜,可適當提高封閉液濃度 |
抗體濃度過高或者作用時間過長 |
降低抗體濃度,抗體作用時間: 室溫 1-2h 或 4℃ 過夜 |
|
洗滌不充分 |
增加緩衝液洗滌次數和時間 |
|
染色定位不對 |
組織細胞中無抗原 |
設立陽性對照,以驗證實驗結果;換其他組織細胞檢測驗證 |
固定方法不當 |
固定劑可分為交聯固定劑和可溶性溶劑固定劑,嘗試換不同類的固定劑處理抗原樣品 |
相關資訊:
- 【ABreal】【Proteintech】 FlexAble Antibody Labeling Kits
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- 【ABreal】免疫螢光染色(IF) 實驗—如何直達完美多重染色?
- 【Proteintech】Immunofluorescence Introduction
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