【Abbkine】粒線體通透性轉換孔檢測(MPTP)不會做？看過來！
【Abbkine】粒線體通透性轉換孔檢測(MPTP)不會做？
看過來！
背景
粒線體膜通透性轉換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)是位於粒線體內外膜間的非特異性通道，似乎參與細胞死亡過程中粒線體成分(components)的釋放。MPTP的開關極大地改變了粒線體的滲透性以及粒線體膜電位。這種持續的孔隙激活是由粒線體Ca2+超載(overload)、粒線體穀胱甘肽(Glutathione)氧化、粒線體活性氧(ROS)水平升高和其他促凋亡條件引起的。MPTP與細胞的生存、凋亡密切相關，對於MPTP的檢測也橫跨了缺血/再灌流(ischemia/reperfusion)、腫瘤、衰老、神經變性(neurodegeneration)等多個領域。我們開發了一款集成像顯微分析和流式分析於一身的用於檢測粒線體轉換孔開放的試劑盒——Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay (KTA4002)。
原理
正常情況下粒線體內會維持較高的Ca2+濃度，以利於肌肉的正常興奮、收縮和舒張，減少細胞質(cytoplasm)中Ca2+濃度升高對骨骼肌超微結構(ultrastructure)的破壞，同時也是敏感性粒線體酶(C3H6O acid dehydrogenase、isocitrate dehydrogenase、α-ketoglutarate dehydrogenase)發揮功能所必需的。
大多數的粒線體會與內質網有一個接觸點，並建立有穩固的連接。有研究表明內質網中Ca2+ 釋放後一部分進入細胞質引起細胞質內Ca2+ 濃度升高，一部分會被臨近的粒線體募集吸收，此時低電導(low-conductivity)滲透性轉換孔在開放和關閉中來回切換。當細胞受到損傷時，低電導滲透性轉換孔滲透性發生改變，Ca2+ 超載導致MPTP激活。
此時向該細胞中加入螢光探針——鈣黃綠素AM (calcein acetoxymethyl ester, 即Calcein AM) 是一種非極性染料，可以對活細胞進行螢光染色。Calcein AM通過被動運輸進入細胞內，並在包括粒線體在內的細胞質成分(components)中累積。Calcein AM在細胞內能被酯酶水解去除乙醯甲酯(acetyl methyl ester)，生成沒有膜通透性的極性螢光染料Calcein 或Fluorexon，從而使Calcein滯留在細胞內以及粒線體中，並使得包括粒線體在內的細胞質顯現強烈綠色螢光。再加入CoCl2用於淬滅(quench)細胞質中Calcein的綠色螢光。正常情況下粒線體的MPTP是關閉的，CoCl2不能進入粒線體，因此在正常細胞中只是細胞質中的Calcein被淬滅；但是受損細胞的MPTP有一定程度的開放，此時CoCl2便可以進入粒線體，因此在受損細胞中除了細胞質中的所有Calcein被淬滅外，粒線體中的Calcein也有不同程度的淬滅。此時我們可以透過流式細胞儀檢測到Calcein的綠色螢光信號，通過比較螢光信號的強度判斷MPTP的開放程度，進而推斷粒線體的損傷程度。
.png)
常見問題解答(Q&A)
Q：該試劑盒目前檢測的樣本類型有哪些？
A：本試劑盒可以對貼壁細胞和懸浮細胞進行檢測，包括：L929 Jurkat等細胞。
Q：組織或粒線體樣品可以檢測嗎？
A：組織的單細胞懸液(Single-cell suspension)可以嘗試。提取出來的粒線體則不適合。
Q：加入氯化鈷(cobalt chloride)後，細胞質內的螢光不淬滅怎麼辦呢
A：可適當減少Calcein-AM的濃度和用量。
Q：最後的結果應該如何分析？不同子群(subgroups)間應該如何比較？
A：據粒線體中Calcein綠色螢光的強弱來判斷粒線體MPTP開放的程度，綠色螢光越強，開放程度越低，綠色螢光越弱開放程度越高。
Q：該試劑盒如何檢測MPTP開放程度？
A：本方法相較基於粒線體膜電位的方法能更直接地檢測到粒線體通透性轉換孔開放程度的變化，根據粒線體中Calcein綠色螢光的強弱來判斷粒線體MPTP開放的程度，綠色螢光越強，開放程度越低，綠色螢光越弱開放程度越高。實驗需要設置陰性對照和陽性對照進行比較，沒有靈敏度和檢測極限數據，螢光顯微鏡、流式均可檢測。
Q：該試劑盒的陰性對照和陽性對照該如何設置？
A：陰性樣本中加入Calcein AM staining solution；陽性樣本中加入Ionomycin control。
Q：該試劑盒染色之後是否可以用DAPI染細胞核呢？
A：如果染核推薦Abbkine的Hoechst 33342活細胞染料(BMD0062)。不可固定。
Q：該試劑盒應該選用哪個通道(channel)進行檢測？
A：選用FITC/488 nm 激發光通道進行檢測。
相關產品推薦
| Product Name | Cat No. | Size |
| Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay | KTA4002 | 50 T/100 T |
| EdU Cell Proliferation Image Kit (Green Fluorescence) | KTA2030 | 100 T/500 T |
| EdU Cell Proliferation Image Kit (Orange Fluorescence) | KTA2031 | 100 T/500 T |
| One-step TUNEL Apoptosis Assay Kit (Green Fluorescence) | KTA2010 | 50 T/100 T |
| One-step TUNEL Apoptosis Assay Kit (Orange Fluorescence) | KTA2011 | 50 T/100 T |
| Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection kit | KTA0005 | 20 T/50 T/100 T |
| Annexin V-AbFluor™ 488/PI Apoptosis Detection kit | KTA0002 | 50 T/100 T |
| Comet Assay Kit (3-Well Slides) | KTA3040 | 15 T/75 T |
| Hoechst 33342 | BMD0062 | 10 mg/100 mg |
參考原文：
https://www.abbkine.com/how-to-dectet-mitochondrial-permeability-transition-pore/
促銷優惠參考：
