常常對實驗高背景感到無奈嗎？教你如何獲得低背景免疫沉澱！

常常對實驗高背景感到無奈嗎?

教你如何獲得 低背景免疫沉澱

上一篇文章 (你累了嗎? 教你如何省時省力高效完成一次免疫沉澱) 中提到了Nano-Trap於免疫沉澱(Immunoprecipitation, 以下簡稱IP)實驗中所展現的高親和力、耐熱及耐化學穩定性，還有縮短實驗時間等種種優勢。

所以接下來要為各位帶來的是， 如何能獲得低背景的IP結果。

那麼想要知道答案，首先便要了解IP的高背景是如何產生的？

background in SDS gel

(註：I代表Input，FT代表Flow Through，B代表Bound)

IP 實驗中的背景通常來自洗滌步驟中沒有被去除的背景蛋白質。這些背景蛋白通常發生在cell lysate的過程中，並與beads產生非特異性結合。而背景蛋白也可能被 SDS sample buffer沖洗後分離出來，最後在 SDS gel的結合部分(B)顯示出額外的條帶。

簡而言之，蛋白質的非專一性結合由與beads和/或親和試劑 (例如：抗體或奈米抗體Nanobody) 之結合所引起。

那麼知道發生的原因後，再來便是如何能夠避免非專一性結合呢？

非專一性結合之可能物質有三種，皆來自於其與背景蛋白之非特異性結合：Beads、奈米抗體 (Nanobody)、塑膠材料 (Plastic tubes)。

1.Beads與背景蛋白

最直接的解決方法是使用Binding control beads (產品代碼：bab-20 和 bmab-20) 進行預清理(pre-cleaning)。Binding controls是指沒有與奈米抗體連接的beads。將其加入cell lysate中，透過離心或磁力分離，並利用IP確認是否有背景蛋白存在。如果在 SDS gel上的結合部分(B)發現條帶，便可使用此方法以改善 IP 結果。

此外，更嚴格的洗滌條件，例如在wash buffer中加入 0.1% 的介面活性劑(Detergent)，也可以減少與beads的非特異性結合。但是，介面活性劑可能不適合用在 Co-IP上。

2.奈米抗體(Nanobody)與背景蛋白

如果背景蛋白與 GFP Nanobody產生非特異性結合，則建議可以改善wash buffer (見下圖)。由於 GFP-Trap非常穩定，因此可以應用在非常苛刻的洗滌條件，如下。

1) 添加介面活性劑，例如：0.1% Triton™ X-100 或 0.05% Nonidet™ P40 Substitute

2) 增加鹽濃度，例如： 150-500 mM NaCl

這些方式都能去除背景蛋白，而且 GFP 所標記的 POI (Protein of interest) 仍然會和beads緊密結合，不會被清洗。

有關Wash buffer的成分，請參考以下經 GFP-Trap 親和樹脂測試的最大濃度兼容成分列表：

Buffer ingredients	GFP-Trap Agarose or Magnetic Agarose	GFP-Trap Magnetic Particles M-270
DTT	1 mM	10 mM
Glycerol	30 %	not tested
Guanidine HCl	4 M	not tested
NaCl	2 M	2 M
Nonidet™ P40 Substitute	tested up to 2 %	tested up to 2 %
SDS	1 %	0.2%
TCEP	0.2 mM	not tested
Triton™ X-100	tested up to 1 %	tested up to 1 %
Urea	8 M	8 M

由於 ChromoTek GFP-Trap 由重組的 GFP Nanobody組成，所以幾乎沒有批次間的差異。因此，wash buffer可用於不同的 GFP-Trap 批次，讓使用上更方便。

3.塑膠材料(Plastic tubes)與背景蛋白

背景也可能由非特異性結合塑膠管(Plastic tubes)表面蛋白質所引起。為避免這種污染，建議在最後一次洗滌步驟中將beads轉移到新的塑膠管(Plastic tubes)中，並且持續更換新的tips和low/non-binding tubes，以及使用帶有界面活性劑的wash buffer。

＊獲得低背景的其他注意事項

1) 增加洗滌步驟的次數和時間以去除非特異性蛋白質背景。

2) 在結合步驟中縮短培養時間。如果培養時間過長，即在 +4°C 下超過 60 分鐘，可能會引起蛋白質聚集，從而導致更高的背景產生。由於 GFP-Trap 的結合反應在 30 分鐘即可完成，因此延長培養時間並不會獲得更高的 IP 產量，只會導致背景變得更深。

3) 特別注意，作為背景蛋白質出現的條帶，實際上有可能是 Co-IP 實驗中 POI 的潛在結合對象。

Binding Controls: Product Formats

	Binding Control Agarose	Binding Control Magnetic Agarose
Matrix	Agarose	Magnetic agarose
Particle size	90 µm	40 µm
Magnetic	No	Yes
Code	bab-20	bmab-20

GFP-Trap: Product Formats

	GFP-Trap Agarose (gta)	GFP-Trap Magnetic Agarose (gtma)	GFP-Trap Magnetic Particles M-270 (gtd)
Bead type	Porous	Porous	Solid
Separation	Centrifugation	Magnet	Magnet
Capacity	+++	+++	+
Size of GFP-POI	Small - large	Small - large	Small - very large
Application	◆ Lowest background ◆ High binding capacity → Matrix of choice	◆ High binding capacity ◆ Easy magnetic separation	◆ Easy magnetic separation ◆ Large proteins / complexes