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免疫療法—如何挑選重組蛋白(Recombinant protein)? E.coli v.s HEK293 表現系統大比拚

免疫療法—如何挑選重組蛋白(Recombinant protein)? E.coli v.s HEK293 表現系統大比拚

   

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免疫療法—如何挑選重組蛋白 (Recombinant protein)?

E.coli v.s HEK293 表現系統大比拚

 

重組蛋白被使用在生命科學領域的眾多應用當中;通常與細胞的健康和生長有關。它們的應用範圍從實驗室的細胞培養到生物加工、幹細胞核心 (stem cell cores),甚至是細胞和基因治療。

重組蛋白包括生長因子,例如:成纖維細胞生長因子 (Fibroblast growth-factor, FGF) 或免疫調節細胞因子 (Immunoregulatory cytokines),例如:誘導細胞生長、分化或增殖的白細胞介素 2 (Interleukin 2, IL-2)。生長因子會直接影響細胞生長或分化,而細胞因子是免疫系統調節劑;啟動免疫反應也能影響細胞分化和活化。它們是通過與特定細胞表面受體結合來活化訊息傳遞路徑 (signaling pathway),進而引發其作用機制的蛋白質。然而,並非所有重組蛋白都是細胞因子或生長因子。例如:重組人血清白蛋白 (HSA) 是一種蛋白質,可作為培養物中的抗氧化劑和穩定劑。

 

 

由於重組蛋白在細胞培養和治療系統中的扮演了重要的角色,因此,在為您自己的培養物選擇重組蛋白時需要考慮幾個因素。

 

1. 重組蛋白來源

用於生產重組蛋白的表達系統對所得產物有相當大的影響。Genentech使用大腸桿菌生產重組人胰島素是開發活性人源蛋白質一個重要的里程碑。從這一個發現以來,隨著研究的不斷推進,對活性重組蛋白的需求也發生了變化。在某些情況下,需要醣基化和轉譯後修飾 (Post translation modification, PTM) 才能實現所需的蛋白質活性;這一點只能通過使用真核生物表達系統來實現。因此,這也導致了昆蟲和哺乳動物(中國倉鼠卵巢 - CHO)系統的發展。然而,對於人類的應用和研究,人類表達系統是最理想的

Proteintech 的 HumanKine 系列重組蛋白源自於人類胚胎腎細胞 (HEK293)

 

 

2. 為什麼要試試HEK細胞來源的重組蛋白?

源自人類細胞 ( HEK293 ) 表達系統的重組蛋白相較於來自細菌系統(如:大腸桿菌)的蛋白,擁有許多優勢,因為它們能夠產生具有天然 PTM 和糖基化(如:Chinese hamster ovary cell, CHO)的人類重組蛋白。然而,Proteintech 的 HumanKine蛋白質比來自其他真核系統(如:昆蟲或 CHO)的蛋白質更具優勢—這些優勢將在下面進行討論。

 

  1. 不含動物和異種成分
  • 最終產品不包含任何來自動物組織、體液或源自於動物的其他成分。
  • 從採購到最終產品的所有材料都在專門的無動物設施中儲存和處理。
  • 最終產品和過程不涉及使用非人類動物來源的材料或由非人類動物來源製成的重組材料。

 

  1. 無標籤
  • 沒有標籤用於蛋白質的表達和純化。
  • 加入標籤通常會導致蛋白質的結構發生變化。
  • 有時標籤會干擾蛋白質的活性位點,導致生物活性改變。
  • 標籤的存在可以增加某些蛋白質的免疫原性 (Immunogenicity),這使得無標籤重組蛋白在體內應用中更受歡迎。

 

  1. 天然人類蛋白醣基化、折疊和成熟
  • 儘管 CHO 和昆蟲細胞是真核細胞,但它們處理人類蛋白質的能力在許多情況下與人類細胞不符。例如,人類細胞可以產生比 CHO 細胞更成熟的Activin A dimers(圖1)。
  • 醣基化對穩定性和活性至關重要。CHO 細胞和昆蟲細胞在這個過程中有著截然不同的機制,會產生與人類非常不同的醣基化物種。

 

▲圖 1. 來自 CHO 細胞和 HumanKine 系統的純化Activin A於SDS-PAGE 凝膠進行Coomassie blue染色,顯示了成熟的Activin A dimers形成。

 

  1. 高穩定性

由於具備天然醣基化等翻譯後修飾,人類細胞表達的蛋白質在穩定性方面遠勝於其他系統。例如,HumanKine FGF 在細胞培養中具有比大腸桿菌衍生的FGF更高的穩定性(圖 2),需要更換的培養液較少。

 

圖 2. 由於與競爭對手的大腸桿菌衍生產品相比,FGF basic-TS 具有一致、卓越的穩定性,因此可以在 37°c 下不含細胞的無血清培養基中穩定長達 3 天。此外,HumanKine 蛋白還具有高純度和一致的批次間活性。

 

  1. 高活性

上述特點協同作用下所產生的蛋白質往往比其他表達系統中產生的蛋白質具有更高的活性(圖 3)。

 

圖 3. 證明與大腸桿菌表達的 TNF α 相比,使用 HumanKine TNF α 時,類風濕性滑膜細胞 (Rheumatoid synoviocytes) 中 IL-6產生的效率更高。

 

  1. 高純度

HEK293 衍生的重組蛋白通常比來自其他表達系統的蛋白質具有更高的純度——Proteinech 的 HumanKine 重組 Wnt-3a 蛋白就是一個例子(圖 4)。

 

Wnt3A 誘導 Hek293 Reporter Cells中的螢光素酶 (Luciferase) 產生 Wnt3A 誘導 MC3T3 E1MC3T3 E1 Mouse Preosteoblast Cells (小鼠前成骨細胞) 產生
圖 4. HumanKine Wnt3A 純度 >90%,而競品的純度為 70-75%;這是目前可用的最純淨的 GMP Wnt3A(左)。它的活性至少是競品的兩倍(右)。

 

3. 產品資訊

公司提供之重組蛋白相關資訊的廣度有助於深入了解公司進行驗證的深度,從而更加了解產品的質量。訊息應包含生物活性(有生物測定驗證)、純度、內毒素濃度和 SDS-PAGE 驗證。

 

  1. 生物活性

在比較不同公司的產品時,重組蛋白的生物活性可能是一個很重要的因素。通常會以 ED 50或 EC 50(能提供 50% 最大活性的劑量 ,越低越好)的型式來提供,單位為ug/mL 或 pg/mL,也可能為units/mg(每1mg可提供之有效劑量,越高越好)。

這些濃度是特定於檢測的,因此雖然它們對於比較來自不同公司的蛋白質活性很有效,但對競爭產品進行並行基準測試 (parallel benchmarking) 以了解哪種產品最適合您自己的應用始終是一種安全可靠的方法。

 

  1. 純度

重組蛋白的純度對最終產品的整體質量有影響。重要的是盡可能使用高純度(最好 > 95%)的蛋白質,以確保您使用的產品不含其他外來蛋白質、內毒素或任何其他可能干擾重組蛋白質生理作用機制的物質。

 

  1. 內毒素水平

已知市售重組蛋白中的內毒素會干擾蛋白質或培養細胞的生物活性。內毒素,如:LPS 可以激活培養中的免疫細胞;即使在“商業上可接受的水平”(1),仍可能造成影響。因此,您購買的重組蛋白不含內毒素或內毒素含量極低,這一點很重要。