T7 RNA Polymerase 2.0, GMP Grade(Cat. No.:GMP-E122-H200)
T7 RNA Polymerase 2.0, GMP Grade
產品資訊
產品描述
作為生物大分子，mRNA可透過體外轉錄（IVT，in vitro transcription）的方法大規模合成，T7啟動子是目前轉錄效率最高的啟動子之一，因此採用T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase）進行體外轉錄可簡單快速獲得大量的RNA分子。 dsRNA作為體外轉錄的副產物之一，能夠被對應的核酸受體識別，引發天然免疫發炎反應，嚴重影響mRNA疫苗的效果，在生產過程中需要嚴格控制。本製品經分子演化改造所得的T7 RNA聚合酶，可明顯降低轉錄產物中dsRNA的含量，降低了合成mRNA自體免疫原性。
轉錄合成的RNA可用於諸如RNA結構與功能研究、RNA酶保護、探針雜交、RNAi、顯微注射及體外翻譯等多方面的下游應用。
產品用途
1) 合成單股RNA；
2) 合成高特異性RNA 探針；
3) 合成siRNA 前驅物；
4) 製作RNA 剪接反應（RNA splicing）的前驅物。
保存條件
-20℃±5℃.
品質管制
無大腸桿菌DNA殘留、無核酸內、外切酶殘留及RNA酶殘留。
注意事項
- 模板效率與孵化時間：
- RNA聚合酶啟動子的序列和長度而有所不同。影響轉錄產量的污染物包括核糖核酸酶或污染物，如苯酚、微量金屬和SDS。
- 優化的反應:
- (4小時-過夜反應)，增加模板的用量來提高產率。
- 保持RNase-free環境：
- RNase管和移液槍；
- RNA的試劑盒組件或樣本時應戴手套，並經常更換手套，特別是接觸到RNase的潛在污染源，如門把手、鋼筆、鉛筆和人體皮膚後。
- RNA的試管密封。
- 在配置反應體系時，可以加入0.5µl近岸蛋白RNase 抑制劑（目錄編號：E125）。
- 由於10×Transcription Buffer含有亞精胺成分，在低溫時會與模板DNA形成沉澱，配製反應液時需在常溫下進行，調整組分加樣順序，計算好體系，先加水、 buffer和NTP，最後加模板和酵素。
疑難排解
1. 質體模板線性化時，如何選擇限制性內切酶？
帶有啟動子的質體可以作為轉錄模板，質體的線性化和純度會影響轉錄的產量及RNA的完整性。環狀質體由於沒有有效的終止，會轉錄出不同長度的RNA產物，為了得到特定長度的RNA，質體必須完全線性化，線性化的質體需確保雙股為平末端或5'端為突出結構。因此需要選擇可以產生平末端或5'端為突出結構的II類限制性內切酶，且酵素的辨識位點為稀有位點。
2. 轉錄模板的純度有要求嗎？
模板DNA應為RNaseA-Free、高純度，建議OD260/280為1.8~2.0。
3. 轉錄模板必須去除嗎？
最好在轉錄結束後加入DNase I去除模板。
4. 轉錄產物產量低或轉錄失敗：
建議做一個對照組和一個實驗組。若對照組產量低，請聯絡近岸蛋白技術支援。若對照組實驗產量正常但實驗組產量低，可能有模板本身的品質問題導致產量低，請嘗試以下方案解決：
a) 實驗模板中有抑制反應的成分，建議重新純化模板，確定模板定量及其完整性；
b) 實驗模板序列問題，建議延長37℃反應時間，增加模板投入量或嘗試其他啟動子和RNA聚合酶。
5. 短片段轉錄產物產量低：
轉錄產物小於0.3kb時，延長反應時間或增加模板量可提高RNA產量。
6. 產物電泳拖尾現象：
a) 實驗操作過程被RNase污染；
b) DNA模板被RNase污染；
建議重新純化模板DNA，所有實驗過程注意RNase污染控制。
7. RNA產物片段大於預期：
質體模板沒有完全線性化或有義鏈3'端為突出結構，建議重新線性化質體模板，確保線性化完全及線性化的質體請確保雙鏈為平末端或5'端為突出結構；
RNA存在未完全變性的二級結構，更換變性膠檢測RNA產物。
8. RNA產物片段小於預期：
a) 模板序列中包含類似T7 RNA聚合酶的終止序列導致轉錄提前中止，建議更換RNA聚合酶嘗試；
b) 模板中形成高階結構，建議加入SSB蛋白嘗試；
c) RNase污染。
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