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〔Proteintech 解析大全〕蛋白純化常見標籤(Tag)的選擇

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〔Proteintech 解析大全〕蛋白純化常見標籤(Tag)的選擇


體外重組蛋白表達技術已經是相當常見的技術。目前，體外重組蛋白表達系統主要有四類：原核表達系統、哺乳動物細胞表達、酵母表達系統及昆蟲細胞表達。

表達的一般實驗包括載體構建-表達鑑定-蛋白純化三大步驟。在構建載體階段，除了一些必要的表達元件，還需要考慮的密碼子優化和標籤(Tag)的選擇。選擇合適的標籤(Tag)不但有利於蛋白的純化，促進蛋白的可溶性，同時也不能影響蛋白的結構功能和下游應用。本文詳細介紹了幾種蛋白純化標籤以及抗體，幫助我們更好的設計實驗。

蛋白純化標籤比較


各個標籤性能對比表

 

  • HIS-Tag蛋白純化的首選標籤

HIS-Tag本身的特性對目的蛋白沒有影響，不會形成二聚體；分子量較小，只有0.84KDa，對蛋白的下游應用不會產生影響；免疫原性低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫並製備抗體；HIS-Tag與細菌的轉錄轉譯機制兼容，有利於蛋白表達；與其他標籤構建雙標籤表達，可用於多種蛋白表達系統，純化條件溫和對蛋白影響較小。

HIS-Tag由6-10個組氨酸殘基組成，分子量不到0.84KDa，通常插入在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表達最常用的標籤，蛋白純化完之後可以不需切除此標籤，也不會對蛋白產生功能影響。同時，蛋白純化步驟簡便，純化條件溫和，對蛋白也不會產生太大影響。

 

  • Flag Tag (DYKDDDDK Tag)

由編碼八個胺基酸的親水性多肽（DYKDDDDK）組成，融合的蛋白在真核表達系統中表達效率會更高。Flag標籤與His一樣，通常不會與目的蛋白相互作用而影響目的蛋白的功能、性質。Flag融合蛋白可以在非變性條件下直接進行親和層析，純化獲得的蛋白活性高，從而提高了純化效率。Flag融合蛋白可以被抗Flag抗體識別，進而通過WB、ELISA等對其進行檢測、鑑定。融合在N端的Flag標籤，可以被腸激酶切除，得到特異的目的蛋白。

 

  • GST-Tag (Glutathione S-Transferase)

GST-Tag相對分子質量較大，約為26KDa，插入在目的蛋白的C末端或N末端，大腸桿菌中常用在N端。GST(穀胱甘肽巰基轉移酶)蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶。一般選擇GST標籤的目的有兩個，一是提高蛋白表達的可溶性，二是提高蛋白的表達量。蛋白表達純化結束後需根據不同的蛋白應用而確定是否切除標籤，標籤較大，切除與否需根據下游應用考慮。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測方法可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

 

  • MBP-Tag (Maltose Binding Protein-Tag)

MBP（麥芽糖結合蛋白maltose binding protein），a.a為346，分子量42.5KDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼，構建時刻放在N端，用來提高可溶性（尤其是真核蛋白）。MBP的折疊需要DnaK-DnaJ-GrpE和
GroEL-GeoES兩個分子的幫助，這可以使這些分子聚集到目的蛋白的附近幫助其正確折疊。另外，以標籤蛋白形式存在的MBP(麥芽糖結合蛋白)可以減少目的蛋白的降解，提高表達產物的水溶性，也為以後對目的蛋白的純化提供了基礎。

 

  • HA- Tag (Hemagglutinin)

Hemagglutinin血凝素是流感病毒表面上發現的抗原性糖蛋白在許多細菌和病毒也都會發現。 它負責將病毒結合到被感染的細胞。血凝素的名稱來自蛋白質在體外引起紅細胞（紅細胞）凝集的能力。

這個蛋白質標籤是位於目標蛋白質C端或N端的蛋白質或肽序列，可促進蛋白質的溶解度，檢測，純化，定位和表達。 HA標籤對應於人流感病毒血凝素（HA）的氨基酸殘基YPYDVPDYA。已設計出許多重組蛋白來表達HA標籤，該標籤不會干擾重組蛋白的生物活性或生物分佈。 該標籤有助於蛋白質的檢測，分離和純化。用特異針對HA標籤的抗體檢查時，HA標籤可用於表達的融合蛋白的Western blot和IHC定位。

 

  • GFP (Green Fluorescence Protein)

綠色螢光蛋白(GFP)是由維多利亞水母(Aequorea victoria)的238個氨基酸殘基(26.9kDa)組成的蛋白質，當被藍光激發時(excitation peak at 395nm)發出綠光(emission peak at 509nm)。 GFP已成為細胞生物學研究中的寶貴工具，因為它的螢光可以在活細胞中觀察到。

 

重組技術的一個重要特徵；將重組蛋白與蛋白質/肽標籤融合，在蛋白質上的標籤蛋白，可以幫助融合重組蛋白的溶解、細胞定位、或通過使用標籤特異性抗體Tag antibody大大簡化純化之過程。
通常使用的標籤抗體(Tag/Control Antibodies)包括：His tag，HA tag，cMYC tag，GST tag和FLAG tag（DYKDDDDK）。
Proteintech 提供了廣泛的tag antibodies，種類齊全，每種標籤抗體表現出高度的特異性，可直接應用於融合蛋白的鑒定與純化。亦可用於各種應用，如Western Blotting，ELISA，IP免疫沉澱和IF免疫螢光實驗。
 

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